凝胶层析是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。固定相为化学惰性的多孔物质——凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被洗脱出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后被洗出。可见，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后流出。